IF=13.8 综述文章 | 小细胞肺癌的无细胞和染色体外DNA分析

在液体活检研究中，循环肿瘤DNA（ctDNA）是多种癌症的重要生物标志物，游离DNA（cfDNA）中突变的检测可提示ctDNA的存在。然而，因ctDNA突变检测灵敏度不理想、克隆性造血变异等因素，一定程度上限制了基于突变的ctDNA检测方法在小细胞肺癌（SCLC）中的临床应用。近年来，cfDNA表观遗传学及染色体外DNA（ecDNA）分析等新兴领域应运而生，通过整合cfDNA的多维特征，将进一步拓展液体活检在SCLC中的应用场景，从而为肿瘤早期检测、分子亚型分型、治疗反应及耐药机制提供更全面的解析。2024年，曼彻斯特大学研究人员在Trends in Molecular Medicine(IF=13.8)上发表了题为"Cell-free and extrachromosomal DNA profiling of small cell lung cancer"的综述文章，重点围绕cfDNA突变分析、甲基化谱分析、片段化谱分析及染色体外DNA（ecDNA）分析四大方向，系统梳理该领域的最.新进展，详细介绍了用于SCLC检测、诊断、预后评估及亚型分型的多种策略，阐述了如何通过cfDNA甲基化模式和片段化特征实现分子亚型识别，并探讨了ecDNA在促进肿瘤异质性和化疗耐药性中的作用及其液体活检潜力。

关键要点

ž cfDNA可为SCLC的分子特征提供重要见解，尤其在组织样本通常稀缺的情况下。

ž cfDNA分析的经典方法基于癌症相关突变的检测。尽管该方法在SCLC的检测和预后评估中显示出价值，但迄今为止尚未被证实可用于亚型分型或治疗分层。

ž 甲基化与片段化cfDNA分析技术在SCLC的检测、诊断、预后评估及亚型分型方面展现出应用前景。

ž ecDNA是存在于细胞核内、不属于染色体的环状DNA结构。它们与SCLC的侵袭性增强和治疗耐药性相关。对游离ecDNA进行谱型分析的能力可增强SCLC的亚型分型和治疗分层。

SCLC的临床挑战与液体活检需求

SCLC是一种高级别神经内分泌癌，约占所有肺癌的15%，其特征是增殖迅速且早期即发生转移，约70%的患者在确诊时已出现转移性疾病。目前尚无针对早期SCLC筛查的专项方案，且与非小细胞肺癌（NSCLC）不同，对高危患者进行低剂量CT扫描筛查并不能降低诊断时的分期或改善生存率。尽管多数SCLC肿瘤对一线铂类-依托泊苷化疗具有高缓解率，但大多数患者会迅速产生耐药性，预后较差：广泛期SCLC（ES-SCLC）中位总生存期仅约9个月，局限期SCLC（LS-SCLC）约为17个月。免疫检查点抑制剂疗法可使ES-SCLC患者中位总生存期延长约2个月，但目前尚无经过验证的生物标志物能预测那10-15%从免疫治疗中长期获益的患者。

SCLC具有高度异质性，基于神经源性转录因子（TFs）的差异表达，已鉴定出ASCL-1（SCLC-A）、NEUROD-1（SCLC-N）、ATOH1、POU2F3（SCLC-P）及"内陷"亚型（SCLC-I）等分子亚型，这些亚型可能具有不同的治疗脆弱性。然而，手术切除的稀缺性及组织活检获取的困难限制了SCLC生物学研究，阻碍了生物标志物的发现与开发。液体活检技术，特别是cfDNA分析，为通过分子特征分析实现肿瘤早期检测、亚型分型及个体化治疗策略提供了最具前景的途径。

cfDNA的来源与释放机制

cfDNA是细胞通过凋亡或坏死途径死亡后释放入循环系统的DNA片段。在SCLC患者中，cfDNA浓度显著高于非癌症人群及其他癌症患者，这使其成为SCLC管理的理想生物标志物。cfDNA的片段化模式具有非随机性，依赖于染色质底层结构，主要来源于凋亡过程产生的短片段（<400 bp），其片段大小分布反映单核小体（166 bp）与二核小体特征。

• SCLC中的cfDNA分型

检测ctDNA的关键挑战在于血浆中仅有少量cfDNA来源于肿瘤。SCLC的ctDNA检测主要依赖于cfDNA中癌症相关基因突变的识别，但癌症相关体细胞突变较为罕见，使得ctDNA检测尤为困难，特别是在早期/低检出量疾病中。靶向分析方法包括检测单个或少量基因突变、大量基因组和/或拷贝数变异（CNVs），全基因组测序（WGS）或全外显子组测序（WES）的非靶向方法能通过利用全基因组规模的大量突变来检测肿瘤信号，具有更高敏感性。一项泛癌研究中，机器学习模型从WGS数据中检测突变并生成gemini评分，可区分SCLC患者与非癌症个体（AUC=0.996）

• cfDNA突变分析

cfDNA突变分析可识别SCLC中具有潜在治疗价值的突变及获得性化疗耐药的生物标志物，cfDNA突变分析常规用于NSCLC检测可治疗性改变以匹配靶向治疗，并正在研究其在评估微小残留病、筛查及预测免疫治疗反应中的应用。在小细胞肺癌中，突变分析检测到的高ctDNA水平与较差的无进展生存期（PFS）和总生存期相关，特定突变谱已被证实与预后相关。血液肿瘤突变负荷（bTMB）的降低与更好的预后相关，而根治性治疗后可检测到的ctDNA则预示着更差的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。

• cfDNA甲基化分析

DNA甲基化改变广泛存在于肺癌早期阶段，并在肺癌发展过程中发挥重要作用。相较于突变改变，甲基化改变具有更高的丰度、更早的出现时间以及更强的组织特异性，这使得cfDNA甲基化分析成为SCLC早期检测和分子亚型分型的理想候选技术。SCLC患者的cfDNA呈现特定甲基化模式，不同于NSCLC但与其他神经内分泌来源肿瘤相似，cfDNA甲基化谱可代表原发肿瘤，CDX肿瘤组织与匹配患者血浆样本的DNA甲基化模式具有高度一致性，cfDNA甲基化分析可识别SCLC转录亚型（SCLC-A、SCLC-N、SCLC-P、SCLC-I），准确率可达100%，可监测肿瘤亚型转换（如从SCLC-A转为SCLC-I时免疫相关基因启动子甲基化改变）。

• cfDNA片段化分析

血浆中的cfDNA高度片段化且以非随机方式被切割。这些片段在结构、大小、片段末端核苷酸序列、长度以及锯齿状或平末端的定位方面存在差异。cfDNA的片段化模式可受染色质结构、基因表达、核小体组织、细胞死亡机制以及来源组织中核酸酶表达等因素影响。-DELFI能准确区分46例肺癌患者（11例SCLC）与385例非癌症个体（AUC=0.90），区分SCLC患者与非癌症个体（AUC=0.96）。针对ASCL1基因13,693个结合位点的片段化模式可区分SCLC患者与非癌症个体（AUC=0.92），以及SCLC与NSCLC/非癌症患者（AUC=0.98）。整合5hmC标记和片段化标记的模型AUC可达0.943（全部）和0.9899（仅限SCLC）。SCLCpheno-seq能以较高准确率（AUC=0.84和0.88）区分ASCL1和NEUROD1亚型。

染色体外DNA（ecDNA）分析

ecDNA是细胞核中不包含在染色体中的环状DNA结构，由染色质与核小体组成。癌症相关的ecDNA属于较大结构（平均1-3Mb），是体细胞癌基因拷贝数变异的主要载体，且与较差的预后相关。研究发现，18.8%（18/96）的SCLC肿瘤中至少检测到一种ecDNA，大多数呈现MYC家族基因的ecDNA扩增，MYCL（33%）、MYCN（22%）、MYC（17%），复杂ecDNA（由多个基因组片段组成）的存在与较差的总生存期相关，来自化疗难治性疾病患者的原发灶及不同转移灶细胞系中，ecDNA数量存在显著差异，表明ecDNA可能促进SCLC的肿瘤异质性和治疗耐药性。

游离环状DNA可在血浆中被检测到，且可能比线性cfDNA更稳定。与线性DNA相比，环状DNA可能具有更高的稳定性及更易穿透细胞膜的特性，这使其成为液体活检的理想候选。血浆cfDNA的提取方法和计算分析需针对环状DNA的分离、富集、表征及直接ecDNA检测进行优化。鉴于ecDNA在数量、大小、结构和复杂性上的多样性，其与其他循环游离DNA（cfDNA）指标相结合，或能为SCLC的分子亚型分型提供更精确的依据。游离ecDNA还能通过提供额外的肿瘤特异性信息，提升其他检测方法的应用价值。例如，ecDNA可与cfDNA甲基化和/或片段化分析相结合，形成多模态分类器。总体而言，游离外源DNA在SCLC中具有辅助预后评估、亚型分型、治疗反应/耐药性预测及监测的潜力。

图3. 无细胞染色体外DNA（ecDNA）分析于分型的理论流程

总结

cfDNA分析在小细胞肺癌中是一个快速发展的领域，其临床应用范围正从突变检测扩展到表观遗传学和ecDNA分析。基于cfDNA甲基化测序和片段化分析等技术已实现SCLC的检测、分子亚型分型及预后评估，而ecDNA分析更为治疗耐药性监测和亚型分型提供了新维度。

多项研究证实，cfDNA甲基化分析在SCLC检测中具有高敏感性和特异性（AUC可达0.99-1.0），整合多种表观遗传特征的多模态机器学习分类器性能显著优于单一方法，与基于突变的ctDNA技术相比，cfDNA甲基化和片段化分析能提供更全面的肿瘤生物学信息，包括转录亚型识别。然而，该领域仍面临挑战：多数研究样本量有限，所识别的分子特征缺乏大规模前瞻性临床验证；机器学习模型可能存在过拟合风险；预分析变量和患者相关因素等混杂因素可能影响模型性能。未来核心任务是开展大规模、设计严谨的前瞻性生物标志物驱动临床试验，建立标准化的cfDNA检测分析流程，将这些发现转化为真正适用于临床的诊断工具，最终通过早期发现和根据患者个体癌症分子特征制定个性化治疗方案，从而改善SCLC患者整体预后。

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