万字综述 | cfDNA：塑造液体活检下一个前沿的特征与属性

细胞游离DNA（cfDNA）是指存在于体液（包括但不限于血液、尿液和唾液）中的片段化DNA分子，这些DNA片段通过多种生物过程从细胞中释放。cfDNA正以其在疾病检测与监测中的微创优势改变液体活检的应用格局，其在肿瘤学和产前检测领域已广泛应用，在移植患者监测中的作用也日益凸显。然而，cfDNA的生成、片段化及清除过程十分复杂，仍需进一步研究。

有证据表明，cfDNA的产生与细胞死亡及DNA修复机制相关，这两种机制均会进一步影响其片段尺寸及其作为生物标志物的适用性。cfDNA片段组学作为一个新兴领域，目前正通过片段大小比例、甲基化模式等非突变特征，探索推动诊断领域的发展。测序技术的发展拓宽了cfDNA在癌症诊断、器官特异性病变检测及指导个体化治疗中的应用，这些进展得益于通过不同方法与生物流体对cfDNA亚群的识别与解析。

近期，加利福尼亚大学David教授团队在Molecular diagnosis & therapy杂志上发表了题为Cell-Free DNA: Features and Attributes Shaping the Next Frontier in Liquid Biopsy的综述文章，系统综述了不同片段大小的cfDNA在结构上的多样性，通过解析这些cfDNA亚群，深入探讨了其独特的生物学来源及临床应用价值。不同cfDNA亚群能为基因组学和表观遗传学特征提供重要见解，有助于加深对基因调控、组织特异性功能及疾病进展的理解，这些关键领域的突破进一步确立了cfDNA作为生物标志物的临床价值。

关键要点

l  当前，针对cfDNA亚组分（超短cfDNA、线粒体cfDNA、核小体cfDNA）的研究正从整体分析转向单独分析。这种研究方式可能显著提升生物标志物的分辨率，改进组织来源识别的准确性，并优化疾病分类方法，从而为精准诊断提供支持。

l  除基因突变外，通过片段组学、末端基序及甲基化谱分析等手段开展的cfDNA非突变分析，能够提供更深入的生物学见解。相比传统的基于突变的研究方法，该分析方式可作为更强大的诊断与预后评估工具。

l  cfDNA技术的创新突破——包括生物体液特异性分析、长读长测序、单链文库构建以及人工智能/机器学习驱动的cfDNA分析——正为早期癌症筛查、治疗监测及个体化医疗领域带来革命性变革。

 

cfDNA的形态

由于DNA制备技术的进步、多种测序方法以及复杂的生物信息学工具的发展，如今已能够识别各种不同构象的cfDNA。

在形态学方面，研究表明cfDNA呈现为线性片段或环状结构。线性片段可能是核小体相关DNA或DNA断裂产生。环状cfDNA可能提示存在不同长度的染色体外DNA，如微DNA（100–400bp）、小多分散环状DNA（100–10,000bp）、附加体（可达1000 kb）以及端粒环。这些片段可能来源于DNA修复机制的错误、同源重组或微同源介导的末端连接。当前，学界讨论的观点多围绕具有线性形态特征的cfDNA。除线性和环状结构外，cfDNA还可能茎环或四链体等其他构象存在，这可能归因于cfDNA中存在嵌入基序（如富含胞嘧啶的序列或G-四链体结构），且这类构象多见于极短长度的cfDNA。

据观察，测序后的片段谱图显示，cfDNA的峰值（即片段数量最多的区域）出现在特定的核小体长度上：单体核小体cfDNA（mncfDNA）约167 bp、双核小体cfDNA（dncfDNA）约320 bp和三核小体cfDNA（tncfDNA）约480 bp。cfDNA的核小体相关长度是由约147bp的组蛋白结合DNA，再加上10bp的连接DNA构成的。近年来，借助长读长测序技术，已鉴定出长度超过3 000bp的cfDNA。类似地，除了单核小体和双核小体长度的峰值外，在40至70 bp之间还观察到一个额外峰值，称为超短cfDNA（uscfDNA）(图1)。

图1.血浆衍生的cfDNA具有不同的片段长度和特征

在病理状态下，尤其是癌症中，研究观察到cfDNA核小体相关片段的平均长度较健康患者更短，通常缩短10-20个bp。因此，长短片段的相对丰度正被用作一种有效的cfDNA生物标志物。针对早期胰腺癌的研究已证实，cfDNA的较短片段中突变富集。利用靶向测序技术探究超短cfDNA（uscfDNA）是否同样富集肿瘤来源的cfDNA，可能是一个值得关注的研究方向。

cfDNA的不同构象也可通过其链性（单链或双链）和长度来区分。例如，uscfDNA主要以单链形式存在，而越来越多的证据表明，mncfDNA通常呈双链构象。cfDNA的其他亚型还包括锯齿状cfDNA和带切口的cfDNA，这些亚型可能由DNA断裂或修复过程产生。同样，单链cfDNA可能源于DNA复制、修复或转录过程，而双链cfDNA则是基因组DNA的典型存在形式。

 

cfDNA形成的相关过程及其特征

cfDNA的生物标志物潜力，取决于其独特的原始生物发生过程——这一过程不仅会影响cfDNA的后续加工处理，还与其功能关联密切（图2）。现有研究证据表明，cfDNA的产生主要源于两种途径：一是细胞死亡等过程中核酸发生裂解，二是DNA修复机制的运作。

理解影响cfDNA产生的因素，可从两个层面切入：在细胞层面，需关注炎症反应、细胞死亡等生理过程；在分子层面，则要研究参与cfDNA释放的核酸酶的分子活性。通过检查炎症和细胞死亡等过程，或参与其释放的核酸酶的分子活性，可以在细胞水平上了解影响cfDNA产生的因素。以下探讨了促成cfDNA起源的生物学和分子过程，同时深入了解其结构特征和相互作用，特别是在基于不同大小的cfDNA亚群的背景下。

图2.促成cfDNA形成的过程与结构特征,包括生物学过程与细胞过程、基因组结构、核小体相关结构，以及表观基因组修饰

• 通过基因组的生物分解代谢促进cfDNA形成的生物过程

细胞死亡（细胞死亡、坏死）

凋亡是促成cfDNA产生的主要生物学过程之一。DNA切割是凋亡过程中的关键步骤：细胞内的DNA会被核酸内切酶切割成较小片段。由凋亡产生cfDNA是一个两步过程：首先，在脱氧核糖核酸酶1（DNase1）、脱氧核糖核酸酶1L3（DNase1L3）和DFFB的介导下，染色质被切割成核小体，进而产生核小体长度的cfDNA。每个核小体由约147bp的DNA缠绕在组蛋白核心上构成；最终，核小体长度的cfDNA会进一步降解为具有10个bp周期性的更小片段，形成凋亡来源cfDNA特有的片段化模式。值得注意的是，除细胞死亡外，uscfDNA峰值的出现，可能还提示存在其他不同的cfDNA释放机制。

了解并评估健康组织通过凋亡产生的全基因组范围cfDNA，有助于绘制并确立不同cfDNA亚群的生理性特征图谱。当细胞死亡过程（即坏死或凋亡）发生异常时——尤其是在肿瘤发生与进展过程中，生理性cfDNA特征图谱的改变可助力临床检测或病情监测。

炎症

cfDNA与炎症之间存在双向作用关系：cfDNA既可以触发炎症反应或影响持续的炎症状态，其自身也会受到炎症反应或持续炎症的影响。在多种有害刺激下，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞会形成胞外陷阱，这是cfDNA产生的常见原因之一。研究表明，炎症加剧、自身免疫性疾病及癌症的发生，会对cfDNA的片段化模式和总量产生影响。在全身性炎症过程中，观察到cfDNA的释放呈现双相模式：首先由造血细胞释放，随后由内皮细胞等非造血细胞释放。此外，研究还发现白细胞介素-8会影响cfDNA的水平。现有研究结果表明，炎症在cfDNA的来源中发挥着重要作用。

• 通过基因组的生物分解代谢促进cfDNA 形成的分子过程

DNA核酸酶活性在塑造cfDNA的片段组学特征中发挥关键作用。核酸内切酶会在特定位点切割DNA，产生具有独特末端和大小的cfDNA片段。这些酶可在细胞过程（如凋亡、坏死、DNA复制及DNA修复）中被激活，并释放出具有特征性片段末端模式的cfDNA。

所有细胞类型均会表达核酸酶。部分核酸酶在主要细胞类型和器官中广泛表达，例如DNase1；而另一些核酸酶（如TREX家族成员）则被证实仅在特定组织类型中表达。以Trex2为例，已知其主要在角质形成细胞中表达，且会与DNase1L2协同作用，促进口腔上皮组织中的DNA降解。这一过程可能导致细胞内降解产生不同的末端基序谱，进而有助于识别来源于口腔角质形成细胞的cfDNA。深入理解组织特异性核酸酶活性，有望开辟新的研究方向——通过末端基序序列实现cfDNA的来源解析。

• cfDNA的结构特征和关联

核小体蛋白相关cfDNA

对核小体结合型cfDNA（nucleosomal cfDNA）的分析，有助于深入理解染色质结构、基因调控机制及疾病状态。核小体蛋白（如组蛋白）在DNA包装成核小体的过程中发挥关键作用，而核小体是染色质的基本结构单位。

对测序后的cfDNA进行序列比对后发现，由于染色质的开放状态存在差异，基因组中特定区域会呈现不同的测序覆盖模式。核小体缺失区域（NDRs）是一类以缺乏核小体为特征的基因组区域，对应启动子、增强子、沉默子等调控元件。因此，留存下来的cfDNA可反映蛋白质与DNA相互作用的足迹。

此外，特定的组蛋白修饰或核小体定位状态，可提示基因的激活或沉默。同时，绝大多数cfDNA都与携带组蛋白修饰的核小体结构相关联。这一现象表明，cfDNA并非裸露状态，而是与核小体蛋白结合存在。

值得关注的是，与mncfDNA相比，uscfDNA等较短序列在启动子序列中富集，这可能提示二者具有不同的基因组来源。uscfDNA与mncfDNA的基因组起源差异，或许意味着这些cfDNA亚群与核小体的关联方式存在不同。

转录因子结合位点关联性cfDNA

由cfDNA可来源于基因组的NDRs，研究观察到cfDNA中包含与转录因子结合位点（TFBS）相关的特定序列基序。具体而言，NDR区域中具有激活作用的组蛋白修饰，可使DNA暴露于各类转录因子，进而促成结合了转录因子的cfDNA产生。

TFBS可反映特定转录因子的活性或相关信号通路的状态。对与TFBS相关的cfDNA进行分析，能为理解DNA、蛋白质及其他调控元件之间的复杂相互作用提供新视角，同时揭示与cfDNA片段相关的分子功能。

目前针对cfDNA中TFBS的研究已发现，部分转录因子（如HOXA家族、FOX家族）的结合位点所在cfDNA片段具有临床应用价值。有趣的是，若能根据cfDNA所携带的TFBS超家族对其进行分类，可能会发现cfDNA在结构和生物学特性上的差异，而这些差异或有助于揭示调控机制的进化保守性。例如，含锌的DNA结合结构域可能在uscfDNA中富集——这类uscfDNA中具有潜在二级结构的序列出现频率更高。这一富集特征或将成为推断cfDNA来源的潜在生物标志物。

甲基化cfDNA

DNA甲基化同样会影响DNA切割过程——而这正是cfDNA产生的关键步骤。甲基化的DNA对某些核酸内切酶的切割具有更强的抗性，进而会产生更长的DNA片段。这一特性可能导致甲基化cfDNA的片段大小向更大尺寸偏移，而这种偏移可通过长读长测序技术检测到。

对甲基化cfDNA的分析，能为理解疾病机制与疾病进展提供重要参考。例如，甲基化cfDNA可用于癌症的早期检测、治疗响应监测，以及潜在治疗靶点的筛选。研究人员已利用甲基化cfDNA（尤其是单核小体长度的甲基化cfDNA），在cfDNA中识别出与疾病相关的差异甲基化区域（DMRs），并将这一信息用于cfDNA的来源细胞解析。

在对比不同cfDNA亚群的甲基化状态时发现：与呈高甲基化状态的mncfDNA相比，uscfDNA表现为低甲基化。

二级结构与重复元件

重复序列和转座元件在cfDNA中含量丰富，对塑造cfDNA的特征图谱发挥重要作用。这些元件可影响cfDNA的片段化模式、甲基化谱及整体结构。

转座元件还可使cfDNA形成二级结构，如环状结构、茎环结构和十字形结构等，这些结构会影响cfDNA的稳定性与功能。此外，这些二级结构还可能改变蛋白质及其他分子与DNA的结合能力，进而潜在影响cfDNA在细胞间通讯中的作用。上述相互作用需在不同cfDNA亚群中进一步探究，例如有研究观察到，与mncfDNA相比，G-四链体等二级结构在uscfDNA中更富集。

此外，cfDNA中重复序列和转座元件的存在，也会对其检测与分析过程产生影响，需借助专门的生物信息学工具和技术。目前，cfDNA中重复序列与转座元件的研究是活跃领域，学界正不断开发新技术以实现对这些元件的精准检测与定量。例如，可利用机器学习算法识别不同疾病状态下cfDNA中重复元件的富集模式；同时，单分子实时测序等新型测序技术的发展，也能为cfDNA的结构及重复元件组成提供高分辨率的解析结果。

囊泡关联和/或包裹的cfDNA

目前已有研究关注具有生物活性的cfDNA与细胞外囊泡（EV）及外泌体（exosomes）的关联——这类cfDNA可能包裹在囊泡内部，也可能附着在囊泡表面。尽管关于囊泡合成的研究已较为丰富，但与囊泡相关的cfDNA释放机制研究仍十分有限。研究观察到，囊泡相关cfDNA的来源多样，可源自核DNA、线粒体DNA，或胞质DNA（胞质DNA的产生与基因组不稳定性、DNA损伤相关，可从细胞核及微核释放到胞质中；也可源自线粒体DNA）。此外，不同囊泡所携带的cfDNA，其拓扑结构（如线性、环状）也存在差异。

综上，不同cfDNA亚群呈现出独特特征，这些特征受其生物学来源、关联物质（如囊泡）及表观遗传修饰的共同影响。若要全面理解cfDNA在疾病检测与治疗领域的应用潜力，必须重视这些特征差异。针对特定cfDNA亚群的详细分析，能够揭示在整体cfDNA分析中可能被掩盖的生物学及病理学信息，最终提升cfDNA的临床应用价值。因此，对各cfDNA亚群的深入研究，有望提高cfDNA在个性化医疗中应用的准确性与有效性。

 

cfDNA的其他来源

• 线粒体cfDNA

线粒体循环游离DNA（mtcfDNA）是cfDNA中研究较少的一种类型，来源于线粒体基因组。线粒体DNA（mtDNA）独立于核DNA存在，负责调控线粒体功能。线粒体基因组由重链（H链）和轻链（L链）构成，包含与细胞呼吸相关的基因。研究发现，肿瘤中存在mtDNA的异常改变。作为液体活检（LB）检测中的有效生物标志物，线粒体来源cfDNA的检测已受到广泛关注。mtcfDNA可通过多种机制释放到生物流体中，包括线粒体损伤、细胞凋亡或主动释放过程。

对mtcfDNA的分析，能为理解线粒体生物学机制及疾病发生机制提供重要参考。研究观察到，mtcfDNA的长度通常在40-70个bps之间，这一范围与核基因组来源的uscfDNA峰值区间重叠。由于样本中可能存在核DNA污染，mtcfDNA的检测与分析面临一定挑战。但随着测序技术与分析方法的发展，目前已能实现对mtcfDNA的高灵敏度、高特异性检测与定量。近年来，通过对甲基化mtcfDNA的分析，研究人员也进一步揭示了其与某些疾病表型的关联。

• 微生物cfDNA

微生物cfDNA是一类来源于细菌、病毒、真菌等微生物的cfDNA。这类cfDNA可存在于生物流体中，尤其常见于感染状态或菌群失调（微生物群落平衡被打破）的场景。此外，共生菌群也可能是局部生物流体中微生物cfDNA的来源——例如唾液中就含有来自多种口腔共生菌的cfDNA。通过微生物cfDNA，可获取关于微生物群落及其对人类健康影响的重要信息，包括病原体的存在与否、微生物组的多样性，以及机体对抗菌治疗的响应情况。

由于生物流体中同时存在人类DNA，且微生物基因组具有高度变异性，微生物cfDNA的检测与分析面临一定挑战。不过，测序技术与分析方法的进步已显著提升了微生物cfDNA的检测与定量能力，使其灵敏度和准确性得到改善。从技术层面看，微生物菌群的高度多样性以及微生物参考基因组组装的不一致性，进一步增加了微生物cfDNA分析的难度。

基于微生物cfDNA开发生物标志物，有望为感染性疾病的诊断与监测带来变革，同时推动靶向微生物组的个性化治疗研发。目前，要充分理解微生物cfDNA分析的潜力及其在人类健康与疾病领域的应用，仍需开展更多研究。

• 不同生物体液中的cfDNA

血液、尿液、唾液等不同生物流体中的cfDNA，在特征和浓度上可能存在显著差异。其中，血液中的cfDNA浓度通常高于其他生物流体，因此常被用于液体活检检测。与之相反，尿液和脑脊液中的cfDNA浓度通常较低，但对于泌尿系统疾病等特定疾病的诊断而言，这类cfDNA可能包含更具针对性的信息。

生物流体所处的局部环境，可能对cfDNA的各项特征产生重要影响。例如，血浆中cfDNA的片段谱与尿液或唾液中的cfDNA片段谱存在明显差异（图3）。不同生物流体中cfDNA的片段化模式和片段大小也各不相同：尿液和唾液中的cfDNA通常比血液中的cfDNA更易发生片段化——这是因为尿液和唾液中均含有高浓度的核酸酶，而核酸酶会加速DNA的片段化过程，最终导致尿液cfDNA和唾液cfDNA的片段化程度更高。这一现象可能暗示，cfDNA在不同生物流体中的清除机制和半衰期存在差异。

此外，研究观察到口腔微生物群是唾液cfDNA的重要来源之一。这一发现具有重要意义，因为它揭示了单一生物流体中cfDNA来源的异质性。不仅如此，不同生物流体中核小体结合型cfDNA与非核小体结合型cfDNA的相对比例也可能存在差异，这一差异或许反映了cfDNA在不同生物流体中释放和清除机制的不同。

图3.使用单链文库制备在不同生物体液中分析cfDNA谱：A.血浆，B.唾液，C.尿

对不同生物流体中cfDNA的分析，能为理解疾病机制与疾病进展提供互补性信息。例如，血液cfDNA的分析可助力解析全身性疾病，而尿液cfDNA和唾液cfDNA的分析则可分别为泌尿生殖系统健康问题、口腔健康问题的研究提供线索。明确不同生物流体中cfDNA的差异，有助于开发更精准、信息更丰富的液体活检检测方法。

目前，尿液cfDNA已应用于膀胱癌的早期检测——通过检测片段化热点实现；同时，借助变异等位基因频率、推断肿瘤突变负荷及基于拷贝数变异的肿瘤比例，尿液cfDNA还可用于膀胱癌患者的微小残留病灶检测与生存期预测。与之类似，在唾液中发现的非突变型cfDNA特征，也展现出用于胃癌早期检测的潜力。

其他生物学考虑因素

• cfDNA在信号传导、免疫调节及生物膜维持中的作用

除生物标志物潜力外，cfDNA的其他生理功能研究仍十分有限。例如，cfDNA的免疫原性或免疫调节作用——研究发现，cfDNA可诱导Toll样受体激活，并介导间充质干细胞中的炎症反应（图4）。

图4.cfDNA下游功能：免疫调节作用、信息水平传递和诱导癌症表型转化、生物膜形成

此外，观察到癌细胞来源的cfDNA可使非癌细胞系产生转移表型。具体而言，cfDNA能改变前列腺细胞系中MMP9、CD44等基因的表达，以及hsa-miR-99b-5p等微小RNA（miRNA）的水平，进而诱导该细胞系呈现恶性表型。

有趣的是，微生物群落利用cfDNA来促进和维持生物膜。 生物膜中的细胞外DNA或cfDNA可以来源于细菌凋亡，或响应应激，通常由群体传感控制。它也可以通过细菌毒素或中性粒细胞细胞外陷阱从宿主细胞中获取，也可以通过非依赖裂解的机制发生。

这些过程均凸显了cfDNA作为下游效应分子的重要性。目前对cfDNA下游影响的评估，多基于整体cfDNA群体；而探究不同长度的cfDNA群体是否具有类似的下游效应，将是一个极具研究价值的方向。

• cfDNA的清除率/半衰期

生物流体中的cfDNA具有瞬时性，其半衰期通常在数分钟至数小时不等。cfDNA的这种动态特性，使其成为极具研究价值的领域，对深化人类健康与疾病机制的理解具有重要意义。

cfDNA从循环系统中的清除涉及复杂的生物学过程相互作用。局部组织摄取、循环动力学、肝脏代谢、肾脏排泄及脾脏过滤等机制，均参与了血液中cfDNA的清除。这一多途径过程确保cfDNA水平维持在较窄的生理范围内，从而维持机体稳态并避免潜在危害。

在癌症等病理状态下，cfDNA的清除动态会发生改变。肿瘤组织及其微环境会释放循环肿瘤DNA（ctDNA），这类DNA携带独特的突变与变异。然而，由于ctDNA在循环系统中丰度极低，如何从cfDNA中区分并识别ctDNA仍是一项重大挑战。预测cfDNA块（称为肿瘤分数，TF）中的ctDNA，已成为液体活检分析的核心目标之一。TF可以通过利用cfDNA的各种特征来预测，据观察，当cfDNA来源于肿瘤细胞时，这些特征会发生变化，例如较短的片段长度，变异等位基因的出现或末端基序的差异。

最近的进展使得在小鼠模型中选择性地启动ctDNA以增强其回收率。这一突破凸显了了解cfDNA和ctDNA差异清除机制的重要性。通过阐明这些过程，研究人员可以制定更有效的策略来检测和分析ctDNA，最终改善疾病诊断和管理。

 

cfDNA分析的技术注意事项

技术考量在cfDNA分析中起着至关重要的作用。cfDNA的制备过程（包括DNA提取或文库构建（图5）会极大影响后续下游分析结果。

图5.影响cfDNA属性的不同技术考虑因素

提取方法的选择会影响不同cfDNA群体的回收率。例如，采用硅胶柱法或磁珠法提取，会对短片段cfDNA的回收率产生不同影响。值得关注的是，一种基于探针的cfDNA提取方法已被应用于直接从生物流体中提取cfDNA。

对于基于下一代测序（NGS）的cfDNA检测而言，DNA制备是关键步骤。片段化的DNA（cfDNA本身呈片段化特征）给DNA制备带来了显著挑战。文库构建方法的差异——如单链文库构建、双链文库构建（含或不含修复步骤）——会影响最终被测序的cfDNA 群体，进而改变分析结果。

全基因组测序（WGS）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）及靶向测序等测序方法，均可用于cfDNA的检测与定量。其中，全基因组测序能提供基因组的全面信息，可用于生物标志物的挖掘；染色质免疫沉淀测序则可用于研究蛋白质与DNA的相互作用，进而解析cfDNA的表观遗传特征；靶向测序则能聚焦特定基因或基因组区域进行针对性分析。具体选择何种测序方法，需根据研究目的与实验设计来确定。

Illumina、PacBio、牛津纳米孔等不同测序平台，因其自身特性不同，会对cfDNA数据的质量与解读产生影响。测序平台对短片段或长片段DNA的测序能力，直接决定了可分析的cfDNA片段范围。例如，PacBio或牛津纳米孔等长读长测序平台，可用于分析长度超过600个bps的cfDNA片段，且借助长读长测序已发现长度约为39.8千bps的cfDNA片段；而Illumina属于短读长测序平台，能生成高质量、高通量的测序数据。

在cfDNA分析中，生物信息学考量同样至关重要。完善的生物信息学质量控制是确保数据质量、避免下游分析出现误差的关键，具体包括评估测序质量、将测序reads（读段）与参考基因组比对、以及检测潜在污染物等步骤。对cfDNA数据进行有效的生物信息学分析，需审慎考虑测序深度、覆盖度、偏倚等因素。此外，cfDNA数据的处理与分析还需借助专门的生物信息学工具和流程，例如用于片段长度分析、甲基化谱绘制的工具。

针对cfDNA特定靶点的检测方法包括基于PCR（聚合酶链式反应）或EFIRM（电化学阻抗光谱）的检测技术。定量PCR、数字PCR等PCR技术是扩增并检测cfDNA的核心手段，但PCR偏倚（如对特定序列的优先扩增）和扩增伪影（如非特异性扩增产物）可能会影响cfDNA分析结果。近期已有研究开发出新方法，可利用PCR对短片段和长片段cfDNA进行分析。此外，不同PCR技术的灵敏度和特异性存在差异，在实验设计阶段需充分考虑这一因素。

通过妥善解决上述技术与生物信息学层面的考量，研究人员可实现对cfDNA及其不同亚群的准确、可靠分析。

 

临床相关性

cfDNA的多种特征——包括突变、单核苷酸多态性（SNP）检测、拷贝数变异、转录因子（TF）相关特征、变异位点检测、甲基化修饰，以及片段组学、末端基序谱等新兴拓扑特征——已被用于应对广泛的临床挑战，且部分应用已纳入国际指南（如癌症监测指南）。本文中主要聚焦其在肿瘤学领域的应用；但除此之外，cfDNA也已广泛用于无创产前检测、移植监测及感染性疾病检测等场景。

• 癌症检测和筛查

基于液体活检的cfDNA，通过分析基因组改变和甲基化模式，在早期癌症检测中展现出巨大潜力。多项研究报道了利用cfDNA甲基化、转录因子结合位点和拷贝数变异等拓扑特征、片段组学以及cfDNA突变谱分析进行单癌种或多癌种早期检测所取得的显著成果。

• 癌症治疗监测、预后和预测

cfDNA的含量与突变特征也被广泛用作癌症预后标志物。研究表明，cfDNA水平升高通常与疾病晚期阶段及不良预后相关。以肺癌EGFR突变为代表的预测性生物标志物，其检测已从单基因检测发展为对血浆ctDNA的更全面分析。

cfDNA在数量与质量上的变化，能为治疗效果提供实时信息。通过分析cfDNA的水平及片段组学特征，可实现对癌症进展、治疗疗效及微小残留病灶（MRD）的评估。研究显示，cfDNA水平下降通常与良好的治疗响应相关，而cfDNA水平稳定或升高则可能提示治疗耐药或存在残留病灶。借助ctDNA变异检测技术，MRD检测的准确性得到了显著提升。

类似地，ctDNA中的肿瘤特异性突变在治疗或手术后的MRD检测中也展现出应用潜力。研究证实，转录因子（TF）相关特征有助于提高基于cfDNA的检测方法的灵敏度与特异性；此外，对于ctDNA释放量较低的患者，尤其是在检测结果不明确的情况下，转录因子相关特征还能帮助区分假阴性与真阴性患者。

目前，cfDNA的临床应用价值主要依赖于对整体cfDNA的分析；然而，针对特定临床场景，聚焦于特定cfDNA亚群（尤其是结合非突变型cfDNA特征），有望显著提升其诊断与预后评估潜力。

 

未来展望

cfDNA研究的未来在揭示人类生物学与疾病复杂性方面具有巨大潜力。随着该领域的不断发展，人们有望更深入地理解cfDNA的诸多作用——包括其在细胞间通讯中的功能、与微生物组的关联，以及作为多种疾病生物标志物的潜力。此外，cfDNA还有可能为基因表达的表观遗传调控机制及疾病发生发展研究提供新的见解。

当前cfDNA分析领域主要聚焦于对整体cfDNA的评估。但近期研究证据表明，血浆中cfDNA呈现的特征会因片段长度不同而存在差异。不同cfDNA亚群所携带的信息都可能成为有效的生物标志物。若将所有亚群混合分析，可能会稀释仅存在于单一亚群中的特异性信息——例如不同长度cfDNA亚群在二级结构出现频率上的差异。目前对不同cfDNA亚群的认知，多来自不同测序方法的应用；但值得注意的是，学界对超短链cfDNA的了解仍相当有限，因为目前仅通过低深度测序方法对其进行了探索。尽管不同测序方法已用于研究cfDNA（尤其是核小体长度cfDNA）的现有特征，但针对uscfDNA的此类研究仍较为缺乏。此外，不同生物流体中cfDNA的相关研究，也为该领域提供了另一个极具探索价值的方向。除了探究不同cfDNA亚群的物理特性与生物标志物潜力外，深入研究各亚群的清除机制及其与生物学过程的关联，也将是一个重要的研究方向。随着cfDNA研究不断突破我们对人类生物学与疾病认知的边界，新的治疗应用场景也有望涌现——例如将cfDNA用作药物递送载体或基因编辑模板。

从技术层面来看，测序技术、PCR技术及生物信息学工具的进步，对充分释放cfDNA的潜力至关重要。未来的技术发展可能还包括以下方向：整合机器学习算法以优化数据分析与解读流程、开发cfDNA分离与检测的新方法。此外，实验方案的标准化及参考数据集的建立也必不可少，这将为确保cfDNA研究的可重复性与结果可比性提供关键支撑。

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